【案例】湘湖實(shí)驗(yàn)室發(fā)表《基于CRISPR/Cas9的羅氏沼蝦基因組編輯體系》

【案例速遞】湘湖實(shí)驗(yàn)室在羅氏沼蝦建立基于CRISPR/Cas9的基因組編輯系統(tǒng)

1. 摘要

近日，湘湖實(shí)驗(yàn)室淡水水產(chǎn)核心種源創(chuàng)制團(tuán)隊(duì)在羅氏沼蝦基因編輯關(guān)鍵技術(shù)上取得了重要突破。

團(tuán)隊(duì)成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)體系，并首次獲得了基因編輯突變體存活個(gè)體。相關(guān)研究成果已發(fā)表于國際期刊《Animals》，發(fā)表題為“Establishment of a CRISPR/Cas9-Based Genome Editing System in?Macrobrachium rosenbergii” （基于CRISPR/Cas9的羅氏沼蝦基因組編輯體系的建立）的研究論文，同時(shí)相關(guān)核心技術(shù)已獲國家發(fā)明專利授權(quán)（專利號(hào)：ZL 2025 1 1156808.3），該項(xiàng)成果為羅氏沼蝦的基因功能解析與分子設(shè)計(jì)育種提供了核心技術(shù)支撐。

在此項(xiàng)研究中，武漢聯(lián)啟未來生物技術(shù)有限公司（以下簡稱“聯(lián)啟未來”“我司”）研發(fā)生產(chǎn)的水平拉制儀HL-1000、磨針儀PG-22C參與了胚胎顯微注射與培養(yǎng)的核心實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。

期刊部分原文截圖

2. 研究速覽

巨型淡水蝦羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）是一種全球養(yǎng)殖的十足目物種，具有高經(jīng)濟(jì)性和營養(yǎng)價(jià)值，但其基因改良因缺乏高效的基因組編輯流程而受限。

本研究中，湘湖實(shí)驗(yàn)室淡水水產(chǎn)核心種源創(chuàng)制團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了CRISPR/Cas9顯微注射系統(tǒng)，系統(tǒng)構(gòu)建了從親本配對(duì)、受精卵可控獲取到胚胎顯微注射操作的完整技術(shù)流程，明確了羅氏沼蝦受精后最佳注射時(shí)間，優(yōu)化了顯微注射針尖開口參數(shù)，相關(guān)技術(shù)形成了流程化方法。

利用該系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)成功編輯了眼發(fā)育基因MrPAX6和性相關(guān)基因MrIAG。使注射后的胚胎發(fā)育成活率、幼體孵化率得到了顯著提升。

這些結(jié)果為羅氏沼蝦建立了高效且可重復(fù)的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，為該商業(yè)重要蝦類的功能基因組學(xué)和遺傳改進(jìn)奠定了基礎(chǔ)。

MrIAG基因編輯羅氏沼蝦

3. 技術(shù)難點(diǎn)：蝦蟹類胚胎注射為何難？

蝦蟹等甲殼類動(dòng)物的胚胎結(jié)構(gòu)特殊——富含卵黃、膜質(zhì)脆弱、對(duì)外界刺激敏感，使得顯微注射成為長期制約基因編輯技術(shù)應(yīng)用的主要瓶頸。

傳統(tǒng)的注射方式成活率低、重復(fù)性差，難以支撐后續(xù)基因編輯與育種研究的開展，長期制約著基因編輯技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用。

期刊部分原文摘要

4. 技術(shù)突破：高精度顯微操作系統(tǒng)保障核心環(huán)節(jié)

材料與方法

4.1. 羅氏沼蝦飼養(yǎng)、交配及胚胎采集

4.2. 羅氏沼蝦胚胎發(fā)育分期

4.3. CRISPR/Cas9組件的設(shè)計(jì)與準(zhǔn)備：MrPAX6和MrIAG編碼序列

4.4. 胚胎顯微注射與培養(yǎng)

微注射使用數(shù)字氣壓微注射器（DMP-400）進(jìn)行。注射針的制備使用了玻璃毛細(xì)管（外徑1.0毫米，內(nèi)徑0.5毫米）。針頭使用可編程水平微量移液器拉拔器（HL-1000）拉出，隨后用微磨機(jī)（PG-22C）拋光，獲得約1微米、2微米或3微米的針頭開口。

羅氏沼蝦胚胎微注射針尖直徑優(yōu)化

（A）使用1微米針頭進(jìn)行微注射的示意圖。紅色箭頭表示注射溶液在胚胎內(nèi)擴(kuò)散。

（B）注射后24小時(shí)內(nèi)使用不同針頭口徑（1 μm、2 μm和3 μm）的胚胎存活率。每次治療包含三次重復(fù)，每組約180個(gè)胚胎。

（C）使用2微米針尖進(jìn)行注射效果。

（D）使用1微米針尖注射結(jié)果。

4.5. DNA提取、PCR擴(kuò)增與測序分析

4.6. 表型觀察與數(shù)據(jù)分析

對(duì)于MrPAX6編輯胚胎，使用ImageJ軟件在8 dpf下評(píng)估眼部色素沉著，以量化眼斑面積。對(duì)于MrIAG編輯的胚胎，死亡率和發(fā)育進(jìn)展每日記錄直到孵化，編輯效率通過上述測序分析確定。

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的MrPAX6靶向誘變及導(dǎo)致的羅氏沼蝦胚胎眼色素表型

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的羅氏沼蝦胚胎中針對(duì)MrIAG的靶向編輯

5. 基因編輯效率驗(yàn)證與種質(zhì)培育成果

在該技術(shù)體系支撐下，研究團(tuán)隊(duì)以眼發(fā)育關(guān)鍵基因MrPAX6和雄性分化核心基因?MrIAG為靶點(diǎn)，基因編輯效率分別達(dá)46.9%和84%。

依托該技術(shù)體系，研究團(tuán)隊(duì)已陸續(xù)攻克基因編輯羅氏沼蝦幼體培養(yǎng)以及向苗種階段穩(wěn)定育成的關(guān)鍵技術(shù)，已獲得了MrIAG基因編輯突變體存活個(gè)體2尾和不同基因編輯的幼體、仔蝦近百尾，這為后續(xù)獲得全雄等基因編輯新種質(zhì)提供了重要材料。

基于該體系，可進(jìn)一步開展短螯、快速生長、抗病等重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的精準(zhǔn)編輯，為后續(xù)構(gòu)建可遺傳的羅氏沼蝦基因編輯新品系奠定基礎(chǔ)。

6. 水平拉制儀HL-1000、磨針儀PG-22C產(chǎn)品介紹

水平拉制儀 HL-1000

水平拉制儀具有編制不同拉動(dòng)程序的能力,可以方便地在一個(gè)儀器上拉制各種類型的玻璃微電極。